搭載多波長激發(fā)光源，調(diào)制模式具備完整的PAM功能，可測量PSⅡ功能性捕光截面Sigma(Ⅱ)
非調(diào)制泵浦探針技術(shù)，可監(jiān)測OEC狀態(tài)與衰減，周期-4-震蕩，類胡蘿卜素三重態(tài)能量弛豫
重要升級：
? 一臺儀器兩種功能：非調(diào)制超快閃光動力學(xué)分析和多激發(fā)波長調(diào)制(PAM)應(yīng)用。新款MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是一款緊湊型儀器，同時包含兩種截然不同的技術(shù)：單翻轉(zhuǎn)閃光動力學(xué)(STK)和PAM技術(shù)。
? 超快時間分辨率：一套完整的快速測量組合(時間分辨率低至0.3μs)，可以探測PSⅡ供體側(cè)放氧復(fù)合體Period-4震蕩和類胡蘿卜素三重態(tài)(Car-trip)的生成與能量弛豫，
? 多激發(fā)波長調(diào)制(PAM) 測量應(yīng)用，可以探測PSⅡ受體側(cè)、電子傳遞鏈和光合作用光化學(xué)活性。
? 兩種技術(shù)組合使用：例如使用3 μs飽和閃光，通過PAM測量光監(jiān)測誘導(dǎo)熒光信號的衰減動力學(xué)。測量光頻率按對數(shù)遞減。
全新功能：
? 高時間分辨率：新的STK探測器提供0.3 μs的時間分辨率。
? 時間分辨閃光響應(yīng)：MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是第一款市售儀器，可以測量飽和 μs 閃光期間的熒光產(chǎn)量，并可以區(qū)分類胡蘿卜素三重態(tài)淬滅(TQ)和供體側(cè)依賴性淬滅(DQ)。
? 高精度：為了詳細(xì)分析閃光響應(yīng)，它們的時間非常精確且可重現(xiàn)，閃光的形狀接近矩形，LED需要大約0.5μs才能達(dá)到完全強度。為閃光配置文件校正提供了一個特殊的例程。
? 極強的閃光：使用EDST發(fā)射器檢測器單元可以實現(xiàn)超過1000000 μmol 440 nm m-2 s-1的閃光強度(每μs產(chǎn)生超過1個激發(fā))。
? 泵浦探針：具有可變暗間隔 ?t(從1μs到10ms)的雙閃實驗，允許對各種形式的淬滅進(jìn)行高度靈活的弛豫測量。
? 周期4振蕩：高達(dá)100Hz(10ms間隔)的閃光頻率可用于閃光序列，以探測放氧復(fù)合物的S狀態(tài)。
? 葉片測量：雖然該儀器最初是為懸浮液測量而設(shè)計的，但EDST發(fā)射器檢測器(STK-flashlamp)裝置也可以單獨用于測量植物葉片。此外，即將推出一種配置，其中兩個發(fā)射器相對于多波長發(fā)射器呈45° 角放置，這允許對葉片發(fā)出的熒光進(jìn)行兩種波長的檢測。
? PAM記錄中嵌入的STK：由于在快速非調(diào)制和PAM測量之間快速切換[8-10μs切換時間]，ST可以放置在傳統(tǒng)測量中的任何位置，例如O-I1-I 2-P或慢速動力學(xué)記錄，所得STK揭示了閃光時刻PS Ⅱ 狀態(tài)的詳細(xì)信息。所有這些結(jié)合在一起，使MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ成為一款非常全面的熒光計，允許用戶以多種不同的方式探測和監(jiān)測PS Ⅱ和光合電子傳遞鏈。
重要升級
? 在多激發(fā)波長(PAM)配置中，用戶可以測量與激發(fā)波長相關(guān)的有效PSⅡ天線尺寸信息：Sigma(Ⅱ)、PS Ⅱ受體側(cè)的反應(yīng)(QA-再氧化)和沿電子傳遞鏈的電子流(O-I1-I2-P/OJIP瞬變)，還可以進(jìn)行飽和脈沖淬滅分析、誘導(dǎo)曲線和暗弛豫曲線， 以及光響應(yīng)曲線，所有這些都適用于5種不同的激發(fā)和測量光波長(440、480、540、590、625 nm)以及可以任意組合應(yīng)用的白光。這樣做的好處是，例如，使用硅藻作為研究對象的人可以在綠色中激發(fā)這些生物，在藍(lán)藻的情況下，可以選擇625 nm來激發(fā)藻膽體或440 nm來激發(fā)核心天線的葉綠素。
? MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的高靈敏度允許使對薄的樣品進(jìn)行測量，即在沒有光質(zhì)和光強梯度的情況下測量樣品，在很大程度上避免了波長依賴性的熒光重吸收。
? 使用濾光片自由選擇檢測波長，例如，能夠檢測熒光λ>700 nm，富含PSI熒光F(I)和λ< 710 nm，富含PSⅡ熒光F(Ⅱ)，可以在相同條件下同時測量。
? 通過比較PAM和閃光動力學(xué)(STK)測量來表征給定樣品的相同狀態(tài)。
? 創(chuàng)建Trigger和Script文件可以進(jìn)行自定義實驗程序測量，充分發(fā)揮用戶自主設(shè)計實驗的創(chuàng)造力。
應(yīng)用概述：
配置選項：
1. 多激發(fā)波長配置：多波長激發(fā)單元(MCP-Ⅱ-E)及其檢測單元(MCP-Ⅱ-D1或MCP-Ⅱ-D2ST)
2. 雙波長檢測(PAM)配置(懸浮液)：需兩個檢測器(MCP-Ⅱ-D1和 MCP-Ⅱ-D2ST)得以允許同時檢測λ<710 nm(主要是PSⅡ)和λ>700 nm(PS Ⅱ+PS I)的熒光。允許兩個波長檢測的葉夾將在不久后推出。
3. 完整配置：STK閃光燈(最大閃光強度> 1.0 mol m-2 s-1)和組合檢測器(MCP-Ⅱ-EDST+MCP-Ⅱ-D2ST)，允許檢測低至約100 ns的信號，添加到多波長(PAM)配置中。這允許訪問PSⅡ供體副反應(yīng)。
4. 用于懸浮液測量的單翻轉(zhuǎn)動力學(xué)(STK)配置：STK閃光燈(MCP-Ⅱ-EDST)與組合檢測器(MCP-Ⅱ-D2ST)組合。
5. 用于葉片測量的單周轉(zhuǎn)動力學(xué)(STK)配置：STK閃光燈作為獨立應(yīng)用：STK閃光燈包含一個用于從樣品表面進(jìn)行熒光測量的檢測器，這使其成為測量樹葉的理想選擇。
PamWin-4 軟件
基本功能和圖形用戶界面：PamWin-4是控制MULTI-COLOR-PAM(-II)和PAM-2500的軟件，由PamWin-3發(fā)展而來，可以處理 MULTI-COLOR-PAM-II的所有新功能。該軟件可在Windows 10（32位和64位）和11操作系統(tǒng)的個人電腦上運行。軟件由3部分組成： SP分析、用于PAM應(yīng)用的快速采集（前3個標(biāo)簽）和用于非調(diào)制閃光分析的單周轉(zhuǎn)動力學(xué) (STK)測量（后2個標(biāo)簽）。
廣泛的應(yīng)用組合也意味著可以在選項卡上定義大量特定應(yīng)用的部分設(shè)置。在新的“ST設(shè)置”選項卡上，不僅可以定義單次、兩次或多次閃光實驗（如下圖第一個示例），還可以定義用于確定周期-4 振蕩的閃光序列（帶或不帶預(yù)閃），如下圖第二個示例所示。
簡單設(shè)置即可定義帶或不帶預(yù)閃的閃光實驗和閃光序列。
用戶可以通過一個簡單的菜單定義單閃或雙閃（或多閃）實驗。后者對于配置泵浦探針測量尤為重要。通過脈沖系列菜單，可以定義閃光燈組。
將“目標(biāo)編號”設(shè)為14，將應(yīng)用14次閃光（在此情況下，間隔為200ms）。
通過兩次預(yù)閃光（此處間隔100ms），可以誘導(dǎo)S3狀態(tài)。通過改變預(yù)閃光和閃光組之間的延遲時間（此處為1秒），可以監(jiān)測S3狀態(tài)的衰減。
分析周期-4振蕩的工具是軟件的一部分（見應(yīng)用）。
對于快速采集數(shù)據(jù)，軟件提供兩種支持。一方面是Trigger文件和Script形式的測量協(xié)議，另一方面是用于分析O-I1瞬變的擬合例程，以確定捕光天線橫截面Sigma(Ⅱ)、單周轉(zhuǎn)閃光后或照明一段時間后的指數(shù)熒光衰減。
軟件附帶的Script和Trigger文件也可用作示例，在此基礎(chǔ)上開發(fā)其他腳本和觸發(fā)器文件。
300 ms多相上升的Trigger文件，1ms后有一次單周轉(zhuǎn)閃光。
在Trigger運行的情況下，Trigger文件中定義的實驗協(xié)議將根據(jù)常規(guī)設(shè)置頁面中的設(shè)置執(zhí)行。
在Script文件的情況下，一個或多個觸發(fā)文件被嵌入時間軸，同時定義實驗不同部分的時間。在腳本中，用戶還可以定義所用不同光源的強度和/或波長；這些設(shè)置可以根據(jù)腳本時間軸的進(jìn)程進(jìn)行更改。下面是一個Sigma(Ⅱ)測定的腳本文件示例，例如可以一次性測量五個不同激發(fā)波長的捕光天線截面。
應(yīng)用實例
來自三個應(yīng)用領(lǐng)域的示例實驗
該軟件將MULTI-COLOR-PAM-II的應(yīng)用程序分為3個部分：
1. 光合活性相關(guān)的應(yīng)用，如誘導(dǎo)曲線，誘導(dǎo)+暗弛豫曲線和光曲線自動程序，或手動測量。
2. 基于腳本的應(yīng)用，如O-I1-I2-P/OJIP瞬變、單周轉(zhuǎn)閃光后QA-的再氧化動力學(xué)、Sigma(II)測定。
3. 基于ST閃光的實驗，如周期4振蕩、類胡蘿卜素三重態(tài)誘導(dǎo)和衰減動力學(xué)，P680+
前兩部分代表PAM應(yīng)用，最后一部分代表單周轉(zhuǎn)動力學(xué)(STK)應(yīng)用。
光曲線/淬滅分析
上圖是測量PS II互補量子產(chǎn)率Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1的光曲線示例。由于記憶效應(yīng)，光強減弱時誘導(dǎo)的動力學(xué)可能與光強增強時不同。這種現(xiàn)象被稱為滯后。這里觀察到的光誘導(dǎo)Y(II)降低和Y(NPQ)升高的完全可逆性是生理健康樣品的特征。
測量快速動力學(xué)(PAM)
通過兩個不同波長測量的O-I1-I2-P瞬變
PAM快相應(yīng)用的一個例子是同時測量兩個不同波長的O-I1-I2-P瞬變：在波長<710 nm處測得的熒光主要是PSⅡ熒光，而>700 n處的熒光則是PSⅡ和PSI熒光的混合熒光。該結(jié)果是由Klughammer等人(2024年)對小球藻細(xì)胞稀釋懸浮液(440nm ML和MT)的測量首次發(fā)現(xiàn)的。
兩種波長的O-I1上升(曲線歸一化為I1)相同。I2和P之間存在差異：與F<710nm相比，在 F>700nm時，I2-P上升更明顯。
下圖是使用雙波長葉片配置（請參閱“配置”），通過440 nm測量光和光化光測量大麥葉片的結(jié)果。
這兩項測量結(jié)果再次歸一化為I1(所有QA均已還原)。同樣，與F<710nm相比，F>700nm處的I2-P上升更為明顯。O-I1的上升動力學(xué)稍慢，這反映出 F<710nm波長處的自吸收比F>700nm波長處高，因此F>700nm波長處來自葉片相對較深的層，那里的有效輻射光強度較低。
功能性捕光截面Sigma(Ⅱ) 測量
參數(shù)Sigma(II)反映了PSⅡ捕光天線的有效截面。Sigma(Ⅱ)的測定（及其波長依賴性）是另一種PAM快速動力學(xué)測量的應(yīng)用。有三個標(biāo)準(zhǔn)可以用來判斷用于 Sigma(Ⅱ)測定的O-I1擬合是否良好：1. 擬合應(yīng)能很好地描述熒光的上升；2. 得到的擬合參數(shù)應(yīng)與生理相關(guān)；3. 獲得的Sigma(Ⅱ)值應(yīng)與光照強度無關(guān)。在這里，觀察到Sigma(Ⅱ)值隨著所用培養(yǎng)物的階段而增加。
在這個實驗中，連通性參數(shù)J被固定為1.2，這是Anne和Pierre Joliot在1964年獲得的值。該數(shù)據(jù)集顯示了近乎完美的擬合、合理的參數(shù)值，本質(zhì)上是高光強度下光強度的獨立性，產(chǎn)生了定義明確的 O-I1 動力學(xué)。
單周轉(zhuǎn)閃動力學(xué)STK應(yīng)用
類胡蘿卜素三重態(tài)衰減
下圖顯示了一組測量值，根據(jù)這些測量值可以確定類胡蘿卜素三重態(tài)衰變動力學(xué)。該數(shù)據(jù)集說明了閃光時間的精度，以及閃光燈提供兩次相隔1μs的相同強度閃光的能力。
閃光長度和熒光誘導(dǎo)
另一個案例是雙閃實驗，其中第一次閃光的長度是變化的，第二次閃光是在第一次閃光40微秒后進(jìn)行的。
閃光序列和閃光模式可以告訴我們一些有關(guān)S態(tài)的信息，即供體側(cè)錳簇的氧化還原態(tài)。它們還能告訴我們不同強度的遠(yuǎn)紅外光的影響。
周期-4 振蕩
軟件可自動得出 Fo、Fm 或 Fv水平的周期-4 振蕩(圖摘自Klughammer等人，2024年)。
在咖啡葉片中，FR1照明已導(dǎo)致可變熒光中的周期-4 振蕩受到強烈抑制。在這種情況下，MULTI-COLOR-PAM-II可以將有效的FR強度進(jìn)一步降低到FR1的10%，這就大大降低了對咖啡葉S態(tài)的影響。
STK和 PAM組合測量
下一個案例展示了如何通過STK和PAM測量光的組合，將精確、高強度和短時間的STK和PAM測量光結(jié)合起來，以監(jiān)測黑暗中的熒光衰減。
在PAM測量中，對受DCMU抑制(藍(lán)色)或未受抑制(紅色)的稀釋小球藻樣本施加3 μs STK閃光。從閃光后100 μs開始，ML頻率從100 kHz對數(shù)下降到10 kHz（圖摘自Klughammer等人，2024年）。
產(chǎn)地：德國WALZ
參考文獻(xiàn)(MULTI-COLOR-PAM-II)
1. Klughammer, C., Schlosser, F. & Schreiber, U. Flash-kinetics as a complementary analytical tool in PAM fluorimetry. Photosynth Res 161, 151–176 (2024). https://doi.org/10.1007/s11120-024-01101-w
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